Q：層析柱堵塞？
A：待純化蛋白樣品中存在固體雜質(zhì)，多見于菌體裂解液直接上樣。建議對樣品微濾 (0.45μm) 處理。
Q：目的蛋白不與介質(zhì)結(jié)合？
A：
? 目的蛋白沒有 His 標(biāo)簽，其原因可能是載體構(gòu)建有誤、表達(dá)提前終止 (C端融合表達(dá)His 標(biāo)簽)、二級翻譯起始 (N端融合表達(dá)His標(biāo)簽)等等。建議測序檢查，或嘗試更換表達(dá)載體。
? His標(biāo)簽折疊在蛋白質(zhì)內(nèi)部沒有暴露。該情況多見于包涵體蛋白在變性條件下的純化。建
議充分變性蛋白，可以嘗試使用更強(qiáng)的變性劑 (如用6 M鹽酸胍代替 8 M尿素)、加入助溶劑 (SDS) 或還原劑 (DTT、β-巰基乙醇) 等方法。
? 緩沖液存在問題。使用 Ni-NTA 或 Ni-IDA 介質(zhì)純化 His 標(biāo)簽蛋白時(shí)，平衡緩沖液與樣品緩沖液中的某些組分可能會(huì)干擾目的蛋白的結(jié)合。
部分組分建議濃度如下 ：
EDTA: ≤0.1 mM (建議不要使用)
DTT: ≤1 mM (不推薦使用)
β-巰基乙醇: ≤20 mM (慎用)
咪唑: ≤20 mM (因蛋白而異)
Q：洗脫液中雜蛋白多？
A：
? 洗脫條件不合適。建議使用咪唑濃度梯度或 pH 值梯度洗脫。不同蛋白質(zhì)最佳洗脫條件不同，需要摸索優(yōu)化。
? 雜蛋白與介質(zhì)存在非特異性結(jié)合。建議在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入一定濃度的咪唑 (推薦濃度 : ≤20 mM，因蛋白而異)，抑制非特異性結(jié)合。
? 雜蛋白與目的蛋白存在非特異性結(jié)合。建議在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入非離子型去垢劑 (Triton X-100: ≤1%)、甘油 (≤10%)、NaCl (≥300 mM)、還原劑 (β- 巰基乙醇 : ≤20 mM） 等組分。
? 目的蛋白降解。建議在低溫下純化目的蛋白，并在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入蛋白酶抑制劑 (如 PMSF)。
? 存在表達(dá)提前終止 (C 端融合表達(dá) His 標(biāo)簽) 或二級翻譯起始 (N端融合表達(dá) His 標(biāo)簽)。建議更換表達(dá)載體。
Q：目的蛋白沒有洗脫？
A：
? 目的蛋白量太少，無法檢出。建議更換靈敏度更高的檢測方法，如用銀染法或 Western Blot 替代考馬斯亮藍(lán)染色，或優(yōu)化上游表達(dá)條件，獲得更多的目的蛋白。
? 目的蛋白沒有結(jié)合介質(zhì)。建議檢測以下全部樣品以確認(rèn)蛋白：上樣前、流出、洗滌、洗脫。
? 目的蛋白結(jié)合牢固。建議增加洗脫強(qiáng)度，如采用更高濃度的咪唑或更低的 pH 值。
